熒光定量PCR法（qPCR）：是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，將『針對(duì)支原體特異性保守序列的探針』做熒光標(biāo)記，使PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物帶有熒光，利用熒光信號(hào)的變化和配套軟件，進(jìn)行DNA擴(kuò)增反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，簡稱qPCR。

優(yōu)點(diǎn)：①靈敏度高、特異性強(qiáng)。

②時(shí)間短，2-3小時(shí)出結(jié)果。

③檢測(cè)結(jié)果可定量。

④操作簡便。

缺點(diǎn)：①對(duì)于已做支原體滅活處理的樣品，由于支原體DNA仍舊存在其中，PCR結(jié)果會(huì)出現(xiàn)假陽性。（可用培養(yǎng)法做補(bǔ)充驗(yàn)證）

②不同廠家生產(chǎn)的試劑盒質(zhì)量差異巨大（由于引物及內(nèi)在設(shè)計(jì)不同），需謹(jǐn)慎選擇，盡量在專業(yè)人員推薦指導(dǎo)下使用。

支原體熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(qPCR經(jīng)典法)(符合歐洲藥典)-熒光定量PCR檢測(cè)-北京締一生物科技有限公司

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• 特點(diǎn)

• 1. 內(nèi)控對(duì)照為獨(dú)立包裝，遵循歐洲藥典和日本藥典操作流程。

• 2. 高特異性，一次檢測(cè)即可涵蓋所有常見易感染細(xì)胞的支原體物種（包括歐洲藥典規(guī)定的9種支原體）。與細(xì)菌和真核DNA無交叉反應(yīng)。

• 3. 高靈敏度，檢測(cè)限可達(dá)到≤10CFU/ml。

• 4. 有相應(yīng)配套的支原體基因組DNA和細(xì)菌基因組DNA，便于特異性驗(yàn)證。

• 5.有相應(yīng)配套的支原體定量標(biāo)準(zhǔn)品，便于后定量檢測(cè)。 操作步驟

• 第1步：樣本處理 a.細(xì)胞培養(yǎng)上清

• b. 生物藥或需遵循藥典的樣本 說明：①樣品基質(zhì)可能會(huì)影響檢測(cè)的靈敏度。收集和篩選更高的樣品量可提高測(cè)定靈敏度。 ②細(xì)胞培養(yǎng)物樣本含豐富的DNA酶，在低溫下也能降解支原DNA，影響檢測(cè)靈敏度。 建議：樣本做DNA抽提處理，實(shí)現(xiàn)較高靈敏度。 推薦：德國MB公司生產(chǎn)的支原體DNA提取試劑盒 Venor® Gem Sample Preparation Kit 該DNA抽提試劑盒已經(jīng)過廣泛驗(yàn)證。 第2步：試劑制備 a. 凍干粉溶解

• b. 反應(yīng)體系制備 b1) 樣品為細(xì)胞上清篩查——反應(yīng)體系制備

• b2) 樣品為生物藥——反應(yīng)體系制備

• 第3步：啟動(dòng)熒光定量PCR儀

• 第4步：結(jié)果判別 FAM通道：檢測(cè)支原體熒光信號(hào)。HEX通道：檢測(cè)內(nèi)控對(duì)照熒光信號(hào)。 支原體DNA和內(nèi)控DNA存在信號(hào)的競爭性抑制。 支原體DNA越多，F(xiàn)AM通道信號(hào)越高，檢測(cè)內(nèi)控對(duì)照的HEX通道信號(hào)越低。 定量需基于Ct值和DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線。 Ct＜40為陽性結(jié)果。Ct≥40為陰性結(jié)果。

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